一、計數生物指示劑分類：

1、濾紙片類：孢子載體為濾紙

1）與培養(yǎng)液分離，滅菌完畢將培養(yǎng)液與濾紙片接觸，依據培養(yǎng)液顏色變化確認滅菌效果。

2）不含培養(yǎng)液，滅菌完畢接種至培養(yǎng)基培養(yǎng)，依據培養(yǎng)基渾濁與否確認滅菌效果。

2、孢子懸液類：孢子載體為液體，直接分散于培養(yǎng)液中，一般整體為安瓿包裝，滅菌完畢直接培養(yǎng)，依據培養(yǎng)液顏色變化確認滅菌效果。

3、不銹鋼片類：孢子載體為不銹鋼片（圓形或長條形），不含培養(yǎng)液，滅菌完畢接種至培養(yǎng)基培養(yǎng)，依據培養(yǎng)基渾濁與否確認滅菌效果。

二、濾紙片類生物指示劑計數方法

1、檢驗所需儀器及物品：

1）儀器：

生物安全柜、通用水浴、振蕩器、培養(yǎng)箱、100~1000μl移液槍、計時器。

2）培養(yǎng)基：

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），至少200ml/瓶×1瓶，融化后45~50℃水浴保溫不超過8h

3）滅菌物品：

a）90mm平皿×8個、1ml帶濾芯槍頭×1盒（含槍頭至少20個，滅菌前先用剪刀剪短頭端約2mm，防止濾紙堵塞影響計數結果）、直徑4-6mm玻璃珠24個、50ml平底試管×4支，經濕熱滅菌124℃、50min后備用，效期內。

b）無菌純化水：9ml/支試管×12支，100ml/瓶三角瓶×1瓶，經濕熱滅菌121℃、15min后備用，效期內。

c） 具體滅菌程序按各滅菌器使用及維護標準操作規(guī)程進行。

d）其他物品：

溫度控制管：1套，包含10ml純化水的試管中同時插入1支水銀溫度計（溫度范圍50~100℃）；

酒精燈、不銹鋼剪刀、刀片、不銹鋼鑷子、無菌75%酒精棉球（效期內）、記號筆等。

2、 檢驗環(huán)境條件：

陽性對照室活菌操作區(qū)的生物安全柜內。

3、檢驗前準備：

1） 預熱通用水浴，設定溫度為99.0℃。

2）人員和物品按照《微生物檢驗用實驗室人物流進出標準操作規(guī)程》入室。

4、檢驗步驟：

1）取待檢濾紙片類生物指示劑4支，確認生物指示劑外型完整無破損。

2）用不銹鋼剪刀剪開或刀片劃開塑料管蓋或其他包裝，用無菌鑷子取出濾紙片，將濾紙片加入1支無菌平底試管中，在該試管中加入5ml的無菌純化水及6顆無菌玻璃珠，平行制備4管，分別記為A、B、C、D管。

3）將4根平底試管放在振蕩器上分別振蕩7min，直到濾紙條浸漬成漿狀（如下圖所示），再在每管中加入5ml無菌純化水，再次振蕩8min。

4）將溫度控制管放入已預熱的水浴中，當溫度控制管中溫度顯示達到或超過95.0℃時，將振蕩后的4支平底試管（含10ml無菌純化水、玻璃珠及*浸漬的濾紙）放入水浴中，使用計時器開始計時，在95~100℃持續(xù)熱擊15min。

5）熱擊完畢后，立即將4支平底試管取出，置于冰浴（0~4℃）中5min（計時器計時）。

6） 取冰浴后的4支試管按下述方法操作。

7）取A管平底試管（10-1），用移液槍從試管中吸取1ml試管中的溶液至無菌純化水管（9ml/支）中，記為10-2，在振蕩器上振蕩10-2管10s，再吸取1ml的10-2管溶液至另一無菌純化水管（9ml/支）中，記為10-3，在振蕩器上振蕩10-3管10s，同法操作稀釋至10-4管（計數管），上述稀釋過程以指示劑質量報告中標示孢子數為6次方為例，為確保稀釋管中的溶液混合均勻以獲得準確的計數，振蕩后要立即移液，沉降的溶液在移液前需要再次振蕩。

8）稀釋倍數=生物指示劑質量報告中標示孢子數的指數－2，若標示量為2.3×105，則稀釋倍數為5－2=3，即稀釋至10-3管計數即可。

9）取計數管在振蕩器上振蕩10s，用移液槍吸取1ml的計數管溶液按檢驗用菌株稀釋及計數標準操作規(guī)程的澆注法進行計數確認，計數用培養(yǎng)基為胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基/胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基，平行制備2塊計數平皿，

10）其余BCD管同7）-9）項下操作，ABCD 4支平底試管共計制備8塊計數平皿。

11）按《微生物檢驗用實驗室清潔衛(wèi)生標準操作規(guī)程》做完清潔后，人員及物品按照《微生物檢驗用實驗室人物流進出標準操作規(guī)程》出室。

12）實驗過程填寫《生物指示劑孢子含量測定記錄（濾紙片類）》及使用設備的相關記錄。

5、培養(yǎng)：

將計數平皿（ABCD管各2塊，共8塊）置于培養(yǎng)箱中，參照生物指示劑質量報告中該菌株孢子要求的培養(yǎng)溫度進行培養(yǎng)，除特殊菌株外，一般培養(yǎng)48h計數。

6、計算：

計數平皿均值（修約至個位）=（（A管計數平皿1#+2#）+（B管計數平皿1#+2#）+（C管計數平皿1#+2#）+（D管計數平皿1#+2#））÷8

回收率=計數平皿均值×10稀釋倍數（指數中的稀釋倍數即4檢驗步驟的8）項下的稀釋倍數）÷生物指示劑標示孢子數×100%